Rezepte für die Nukleinsäureanalytik

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In dieser Sammlung finden Sie:

Agarose | Cracking-Puffer | Ethidiumbromid | PBS | Silberfärbung | TAE-Puffer | TBE-Puffer | TE-Puffer

 

Agarose

Für viele Nukleinsäuretrennungen ist 0,8%-ige Agarose das Mittel der Wahl.

  • Geben Sie die Agarose (z.B. TopVision LE GQ Agarose von Fermentas, R0491) in eine 250 ml Schraubglasflasche.
  • Geben Sie 2 ml 50-fachen TAE-Puffer und 98 ml demin. Wasser hinzu.
  • Wiegen Sie die Flasche mit Inhalt.
  • Erhitzen Sie die Suspension in der Mikrowelle ohne Deckel vorsichtig bis sie kocht (aufklart). Tragen Sie dazu Handschuhe und achten Sie auf einen Siedeverzug.
  • Wiegen Sie die Flasche nun erneut und füllen Sie bis zum ursprünglichen Gewicht mit warmem demin. Wasser auf. Schwenken Sie die Flasche anschließend leicht, um eine homogene Lösung zu erhalten.
  • Lassen Sie die Agarose auf ca. 50°C erkalten, bevor Sie sie in die Gelkammer gießen. Setzen Sie sofort den Kamm zur Ausbildung der Probentaschen ein. Erkaltete Agarose erscheint grau-opak.
  • Hinweis: die Agarose kann zum regelmäßigen sofortigen Gebrauch im Brutschrank bei 50°C aufbewahrt werden.



Cracking-Puffer

pH-Wert
> 12
Konzentrierung
1-fach, gebrauchsfertig
Menge
1 ml
Zusammensetzung:
Substanz
Menge
Molarität
Molekular-
gewicht
Lieferfirma, Bestellnummer
 
Saccharose
200 mg
584 mM
342,30 g/mol
vwr, 1.07687.0250
NaOH (2 M)
100 µl
200 mM
40,00 g/mol
Fluka, 71692
Natrium (Sodium)-Dodecylsulfat, SDS (10%)
50 µl
1,7 mM
288,38 g/mol
vwr, 8.17034.1000
Herstellung:
Mit sterilem Wasser auf 1000µl auffüllen.
Anwendung:
Zelllyse von Bakterien zur Freisetzung von Plasmid-DNA. Der alkalische pH-Wert führt zum Abbau der RNA. Keine Restriktionsendonuklease-Verdaue möglich.
Sicherheitsdatenblatt
NaOH, SDS

 

 

Ethidiumbromid (EtBr)

  • Färbung von Nukleinsäuren in verschiedenen Trennmedien (u.a. Agarose)
  • Geben Sie 10 µl Ethidiumbromidstammlösung (10 mg/ml demin. Wasser, z.B. Roth 2218.1) in 100 ml einfach konzentrierten TAE-Puffer.
  • Hinweis: Beachten Sie dabei die Sicherheitshinweise für das Ethidiumbromid und tragen Sie unbedingt Schutzhandschuhe.
  • Ist wochenlang bei Raumtemperatur in geschlossener, lichtgeschützter Plastikwanne lagerfähig.
  • Benötigt einen UV-Transilluminator (ca. 300 nm Anregungswellenlänge), um den DNA-EtBr-Komplex sichtbar zu machen. Kurze DNA-Moleküle lagern weniger EtBr-Moleküle ein; sie erscheinen daher schwächer gefärbt.
  • Nachweisgrenze: gerade noch sichtbar sind 5-10 ng DNA
  • Bilddokumentationssystem (z.B. digitaler Fotoapparat mit einem GelStar Photographic Filter (Biozym, Best-Nr: 850536) )
  • Alternativen: SybrGreen (MoBiTec, S-7580) oder SybrSafe (MoBiTec, S-33100) sind empfindlicher, teurer und photo-oxidativ. Benötigen einen Dark Reader als Transilluminator.
  • Sicherheitsdatenblatt: Ethidiumbromid,



PBS, phosphate buffered saline

pH-Wert
7,4
Konzentrierung
1-fach
Menge
1000 ml
Zusammensetzung:
Substanz
Menge
Molarität
Molekular-
gewicht
Lieferfirma, Bestellnummer
 
NaH2PO4
2,07 g/l
15 mM
137,99 g/mol
Fluka, 1.06346.0500
NaCl
5,84 g/l
100 mmol
58,44 g/mol
Fluka, 71380
Na2HPO4
12,06 g/l
85 mM
141,96 g/mol
Fluka, 71642
Herstellung:
Mit demin. Wasser auf 1000 ml auffüllen, pH einstellen (HCl oder NaOH je 2M) und autoklavieren.

 

 

Silberfärbung

siehe unter Proteinanalytik



TAE-Puffer (Tris EDTA Acetat)

pH-Wert
8,0
Konzentrierung
50-fach
Menge
1 l
Zusammensetzung:
Substanz
Menge
Molarität
Molekular-
gewicht
Lieferfirma, Bestellnummer
 
Tris
242,2 g/l
2 M
121,21 g/mol
Fluka, 93352
EDTA
37,2 g/l
100 mM
372,2 g/mol
Fluka, 03680
Herstellung:
Substanzen einwiegen mit demin. Wasser auf 500 ml auffüllen, mit konzentrierter Essigsäure auf pH 8,0 einstellen, dann mit demin. Wasser bis auf 1000 ml auffüllen.
Anwendung:
Zum Gebrauch 1 Teil Puffer mit 49 Teilen demin. Wasser verdünnen. Lauf- und Gelpuffer der Agarosegelelektrophorese. EDTA hemmt Nukleasen.
Sicherheitsdatenblatt
Tris, EDTA, Essigsäure

 

 

TAE-Puffer (Tris-EDTA-Acetat) für Elchrom Gele

(Fingerprinting)
pH-Wert
8,0
Konzentrierung
40-fach
Menge
1 l
Zusammensetzung:
Substanz
Menge
Molarität
Molekular-
gewicht
Dichte
Lieferfirma, Bestellnummer
 
Tris
145,37 g/l
1199 mM
121,21 g/mol
Fluka, 93352
EDTA
11,16 g/l
30 mM
372,2 g/mol
Fluka, 03680
Eisessig
34,4 ml
601,5 mM
60,05 g/mol
1,05 g/ml
Roth, 3738.4
Herstellung:
Substanzen einwiegen mit demin. Wasser auf 1000 ml auffüllen.
Anwendung:
Zum Gebrauch verdünnen Sie 1 Stammlösung mit 39 Teilen demin. Wasser.
Sicherheitsdatenblatt
Tris, EDTA, Essigsäure

 

 

TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA)

pH-Wert
8,0
Konzentrierung
10-fach
Menge
1000 ml
Zusammensetzung:
Substanz
Menge
Molarität
Molekular-
gewicht
Lieferfirma, Bestellnummer
 
Tris
121,1 g/l
1 M
121,21 g/mol
Fluka, 93352
EDTA
3,72 g/l
100 mM
372,2 g/mol
Fluka, 03680
Borat
51,53 g/l
833,4 mM
61,83 g/mol
Fluka, 15670
Herstellung:
Substanzen in eine Flasche geben und mit 500 ml demin. Wasser auffüllen, mit NaOH (2M) auf pH 8,0 titrieren und dann mit demin. Wasser auf 1000 ml auffüllen.
Anwendung:
Alternativer Puffer für die Molekularbiologie. Verdünnen Sie 1 Teil Puffer mit 9 Teilen demin. Wasser.
Sicherheitsdatenblatt
Tris, EDTA, Borat

 

 

TE-Puffer (Tris-EDTA)

pH-Wert
8,0
Konzentrierung
1-fach, gebrauchsfertig
Menge
1000 ml
Zusammensetzung:
Substanz
Menge
Molarität
Molekular-
gewicht
Lieferfirma, Bestellnummer
 
Tris
1.21 g/l
10 mM
121,21 g/mol
Fluka, 93352
EDTA
0,372 g/l
1 mM
372,2 g/mol
Fluka, 03680
Herstellung:
Substanzen in eine Flasche geben und mit 500 ml demin. Wasser auffüllen,mit HCl (2 M) auf pH 8,0 titrieren und dann mit demin. Wasser auf 1000 ml auffüllen.
Sicherheitsdatenblatt
Tris, EDTA,