Glucose-Bestimmung

Alternative Glucose-Bestimmung

Allgemeines | Material | Methode | Ergebnisse | Sicherheit

 

Allgemeines

Diese photometrische Glucose-Bestimmung erfolgt durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion der Glucose-Oxidase (EC 1.1.3.4) und der Meerrettich-Peroxidase (EC 1.11.1.7). In der Reaktion wird der Redoxindikator ABTS (2,2´-Azino-di(3-ethyl-benzthiazoloin-6-sulfonsäure, Diammoniumsalz) aus seiner farblosen reduzierten Form in die grüngefärbte oxidierte Form überführt.

Glucose-Oxidase: beta-D-Glucose + H2O + O2 ----> D-Gluconsäure + H2O2

Peroxidase: H2O2 + 2 ABTSred -----> 2 H2O + 2 ABTSox (grün)

Die Reaktionsgleichgewichte liegen auf der rechten Seite.

Abbildung 1: Strukturformel des reduzierten (oben) und des zum stabilen, grüngefärbten Radikalkations oxidierten ABTS (unten).

 


Material

Glucose-Reagenz: Geben Sie folgende Substanzen in der angegebenen Reihenfolge zusammen:

  • 17,6 g Na2HPO4 x 12 H2O
  • 7,55 g NaH2PO4 x 2 H2O
  • gelöst in 1 Liter demin. Wasser
  • es sollte ein pH= 7 eingestellt sein (bitte kontrollieren Sie den pH-Wert).
  • 0,5 g ABTS (oder 0,9 mM im Test)
  • 3,35 mg GOD (entspricht 0,7 U/ml oder 2,1 U im Test)
  • 6,65 mg POD (entspricht 0,7 U/ml oder 2,1 U im Test)

Halten Sie diese Lösung auf Eis. Sie muss jeden Tag frisch angesetzt werden.

0,5 mM Glucose-Stammlösung: 100 mg Glucose Monohydrat gelöst in einem Liter demin. Wasser.

Enzyme und Redoxindikator:

  • Glucose-Oxidase z.B. von Roche (2208121)
  • Peroxidase z.B. von Roche (0413470)
  • ABTS von Roche (0102946)


Methode

Pipettieren Sie in 10ml-Reagenzgläser

  • 3 ml Glucose-Reagenz
  • 0,2 ml Probe
  • inkubieren Sie den Ansatz 30 min bei 37°C (Heizblock oder Wasserbad)
  • messen Sie die Extinktion bei 405 nm (Filterphotometer) bzw. bei 415 nm im Spektralphotometer

Abbildung 2: UV-vis Spektren des ABTS.

 

Pipettierschema für die Kalibrierkurve:

Tabelle 1: Pipettierschema für die Glucose-Kalibrierkurve

Proben-Nr12345
0,5 mM Glucose-Stammlösung (µl)-204080120
demin. Wasser (µl)20018016012080
Glucose Reagenz (ml)33333

 

Messen Sie die Kalibrierkurve in Doppelbestimmung. Die Probe 1 ist der Blindwert, da diese Probe keine Glucose enthält.

Schätzen Sie bei einer Glucose-Probelösung den möglichen Glucosegehalt ab und verdünnen Sie entsprechend die Probe, damit die zu erwartenden Messwerte im Bereich der Kalibrierkurve liegen.

Beachten Sie, dass die Messung eine Redoxreaktion ist. Wenn Sie eine Probe aus einer komplexen Matrix (z.B. Lebensmittel mit Ascorbinsäure etc.) messen, so können sich Störungen durch reduzierende oder oxidierende Bestandteile ergeben. Diese Störungen können über die Methode des "Internen Standards" bestimmt und herausgerechnet werden.

 

Ergebnisse

Folgende Messwert der Doppelbestimmungen könnten Sie mit der Kalibrierkurve erhalten:

Tabelle 2: Messwerte zu einer Glucose-Kalibrierkurve

ProbeE405E405delta-E405
10,1440,1440
20,1850,1890,043
30,2250,2300,084
40,3150,3100,169
50,4100,4150,269

Die delta-E405-Werte errechnen sich aus den Mittelwerten der Doppelbestimmungen nach Abzug des Blindwertes (Probe 1).

 

Sicherheit

ABTS könnte gesundheitsschädlich sein.

Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien

ABTS20 KB
Glucose-Oxidase28 KB
Peroxidase20 KB