Stammkultur

Methode

Anlegen | Schrägagarröhrchen | Reaktivierung | Öffnen einer DSMZ-Stammkultur

Die Stammkulturen werden nach folgenden Schritten angelegt:

Züchten Sie in 20 ml Reagenzgläsern Ihren E. coli Stamm in 5ml LB-Medium bis zu einer O.D.600 = 1-2.

Abbildung 1: Verdünnungsreihe zur Abschätzung der Optischen Dichte (O.D.600). Die letzte Verdünnung (O.D.600=0,15) zeigt nur noch eine geringe Trübung.


Daraus legen Sie eine tiefgefrorene Stammkultur und ein Schrägagarröhrchen an. Abschließend üben Sie die Reaktivierung. Für das Öffnen/Reaktivieren von DSMZ-Kulturen gibt es eine gesondert Anweisung (pdf, 120 KB).

 

 

Anlegen einer tiefgefrorenen Stammkultur

  1. Entnehmen Sie steril 2ml aus dieser Kultur und zentrifugieren Sie diese in einem sterilen Eppendorfreaktionsgefäß ab (1 min, 4000 Upm, RT). Sie können diesen Schritt auch ein-oder zweimal wiederholen, um eine höhere Bakteriendichte einzustellen.
  2. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie auf den Bakterienniederschlag 200µl 15%-iges steriles Glycerin.
  3. Resuspendieren Sie die Bakterienzellen im Glycerin.
  4. Portionieren Sie diese Suspension in 50 µl Volumina in sterile Eppendorfgefäße mit Schraubverschluss.
  5. Beschriften Sie das Gefäß.

  6. Frieren Sie diese Zellsuspensionen bei mindestens -20°C ein.
  7. Legen Sie eine Datenbank zu Ihren Isolaten an.

 

 

Anlegen eines Schrägagarröhrchens

  1. Bereiten Sie mehrere Schrägagarröhrchen für einen zu konservierenden Stamm vor.
  2. Erhitzen Sie LB-Agar (LB-Medium mit Zusatz von 1,5 g Agar pro 100 ml Medium), bis der Agar gelöst erscheint.
  3. Homogenisieren Sie diese Lösung und füllen Sie 7ml dieser Lösung in 20ml Reagenzglaser ab.
  4. Verschließen Sie diese Reagenzgläser mit Alu-Kappen.
  5. Autoklavieren Sie ihre Agar-Röhrchen (20 min, 121°C, 1bar Wasserdampfüberdruck).
  6. Entnehmen Sie die noch heißen Röhrchen aus dem Autoklaven und legen Sie diese Gefäße in schräger Lage auf eine Stativstange, die Sie mit Tesaband auf der Laborbank fixiert haben.
  7. Lassen Sie die Agarröhrchen erkalten.
  8. Streichen Sie auf dem erstarrten Agar mit der Impföse Ihren zu konservierenden Stammes in einer Zickzacklinie aus.
  9. Bebrüten Sie ihre Stammkultur für ein bis zwei Tage bei 37°C, bis Sie eine deutliche Spur aus Bakterienzellen entlang des Ausstriches erkennen können.
  10. Wickeln Sie um die Alukappe auf dem Reagenzglas einen Streifen Parafilm und stellen Sie diese bewachsenen Agarröhrchen in den Kühlschrank bei 4-8°C. Der Parafilm verhindert das Austrocknen der Agaroberfläche.

 

 

Reaktivierung einer tiefgefrorenen Stammkultur

  1. Desinfizieren Sie mit 70%-igem Ethanol die Aussenseite der Stammkulturgefäße, bevor Sie den Schraubdeckel öffnen.
  2. Verwenden Sie sterile Zahnstocher, die Sie mit einer abgeflammten Pinzette anfassen.
  3. Stechen Sie ein oder zweimal in die gefrorene Glycerin-Kultur. Notfalls tauen Sie die Glycerinkultur im Eisbad auf.
  4. Geben Sie den kontaminierten Zahnstocher in ein 20 ml Reagenzglas, das 5ml LB-Medium enthält.
  5. Inkubieren Sie diese Kultur samt Zahnstocher bei 37°C.
  6. Frieren Sie den Rest der Stammkultur sofort wieder ein, bevor sie aufgetaut ist.

 

 

Öffnen einer DSMZ-Stammkultur

Die offizielle Anweisung der DSMZ als pdf-Datei (120 KB).