Polymerasekettenreaktion (PCR)

Methode

Das Verfahren gliedert sich in folgende Schritte:

  1. Pipettieren Sie 18 µl steriles Wasser auf die Ready-to-go beads. 
  2. Geben Sie jeweils 0.1 -1 µM forward und reverse Primer hinzu. 
  3. Geben Sie 10 pg bis 1 µg Matrizen-DNA hinzu. 
  4. Mischen Sie den Ansatz gut und achten Sie darauf, dass sich die Flüssigkeit komplett am Boden des Reaktionsgefäßes befindet. 
  5. Starten Sie Ihr PCR-Gerät.
  6. Nach einleitender Denaturierung (3 min, 95°C) werden 35 Zyklen durchgeführt:
    1. Schmelzen doppelsträngiger DNA: 90 sec bei 94°C 
    2. Primer-Hybridiserung: 90 sec bei 50°C 
    3. DNA-Amplifizierung: 2 min, 72°C
  7. Abschließend werden mögliche unvollständige Amplifikate in 30 min bei 72°C komplettiert.

Analyse des PCR-Produktes (RFLP-basiertes Fingerprinting):

  1. Entnehmen Sie 5 µl PCR-Produkt und verdauen Sie die DNA mit Eco RI: 
    1. 12 µl Wasser
      5 µl PCR-Amplifikat
      2 µl RE-Puffer
      1 µl Eco RI-Enzym
      Inkubation bei 37°C für 1 h oder über Nacht
      Mische 5 µl dieses Verdaus mit 2 µl loading dye und trage diese Probe auf ein 0.8%-iges Agarosegel auf.
  2. Verwenden Sie ein 0,8%-iges Agarose-Gel zur Auftrennung der PCR-Produkte und deren Restriktionsverdaue. 
  3. Mischen Sie jeweils 5 µl PCR-Produkt bzw. 5 µl verdautes PCR-Produkt mit 2 µl loading dye. Nutzen Sie als Längenstandard die "1 kb DNA Ladder".
  4. Führen Sie die Agarosegelelektrophorese durch und dokumentieren Sie Ihr Ergebnis.