Nachweis einer mehrfachen Antibiotikaresistenz

Material

Sie benötigen:

  • eine Enterobacterien-haltige Wasserprobe (Teichwasser, Stadtbrunnen, etc)
  • Thermoblock oder Wasserbad bei 98°C
  • Eppendorfzentrifuge und Eppendorfgefäße
  • Pipetten mit passenden sterilen Pipettenspitzen
  • steriles Wasser
  • sterile Eppendorfreaktionsgefäße
  • Eis
  • 100 bp ladder (z.B. von Fermentas: SM0241 (1x0,05mg) oder SM0242 (5x 0,05mg))
  • PCR-Gerät mit folgendem Temperaturprogramm:
    • 1 min bei 94°C
    • 35 Zyklen zu:
      • 60 sec bei 94°C
      • 30 sec bei 55°C
      • 2,5 min bei 72°C
      • mit einer abschließenden Komplettierung für 10 min bei 72°C.
  • PuReTaq Ready-to-go PCR-beads (0,5 ml oder passend zu Ihrem PCR-Gerät; GE Health Care, Bestellnummer: 27-9558-01)
    • geben Sie jeweils 1 µl Primerlösung (jeweils 10 pmol)
    • 5 µl Template-DNA-Extrakt
    • steriles Wasser ad 25 µl in diese Gefäße
  • Primer:
    int1.F: 5´-GGGTCAAGGATCTGGATTTCG-3´
    int1.R: 5´-ACATGCGTGTAAATCATCGTCG-3´
    Synthese dieser Primer z.B. durch Biomers
  • Agarosegelelektrophorese: 2,5%-iges Agarosegel in TAE-Puffer, 10 V/cm
  • Fotodokumentationssystem z.B. digitaler Fotoapparat mit einem GelStar Photographic Filter (Biozym, Best-Nr: 850536) und einem UV-Transilluminator.

Optional:

  • NucleoSpin Extract Kit (Machery & Nagel, Best-Nr: 740609.50) zur Reinigung des PCR-Ansatzes.
  • Restriktionsendonukleasen, wie z.B. PvuII und/oder BglI z.B. von Fermentas für eine RFLP (restriction fragment length polymorphism) Analyse des PCR Produktes.