Voraussetzungen

Dieser Versuch ist vom erforderlichen Material und von der Auswertung her relativ einfach. Sie benötigen eine Probenahmevorrichtung und einen Inkubationschrank mit 37±1°C.


Zeitbedarf: hängt von der Anzahl und der Entfernung Ihrer Probenahmestellen ab. Für die Inkubation der Proben sind 18 Stunden vorgeschrieben, bzw. eine Nachkontrolle nach 48 h. Die Auswertung erfordert pro Probenstelle etwa 5-10 min.

Folgeexperimente: Sie können Clostridium perfingens nachweisen, wenn Sie die "anaerobe Kulturtechnik" beherrschen.

Aufgaben

  1. Sammeln Sie Wasserproben in sterilen 1-Literflaschen aus Badeseen, Fließgewässern oder Brunnen.
  2. Untersuchen Sie diese Proben quantitativ auf den Gehalt an E.coli und Coliforme Bakterien.

Lernziele

Sie lernen die "offizielle" Methode zum Nachweis fäkaler Keime im Badewasser kennen. Damit verstehen Sie leichter, auf welcher Grundlage Gesundheitsbehörden manchmal die Sperrung von Badegewässern veranlassen. Das Prinzip der Untersuchung kann leicht auf Trinkwasser- und Lebensmitteluntersuchungen ausgedehnt werden.

Zusatzinformationen

Darmflora | Idexx-Verfahren

Darmflora

E. coli wird als Leitkeim für fäkale Verunreinigungen genutzt, obwohl dieser Keim zahlenmäßig nicht der häufigste Keim im menschlichen Darm ist. Er ist jedoch relativ schnell, einfach und spezifisch nachweisbar.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Bakterienpopulation im menschlichen Darm (nach W.E.C. Moore, L.V. Holdeman, Appl. Microbiol. 27 (1974), 961-979)

SpeciesKeimzahl (10n pro g Trockenmasse)%
Bacteroides vulgatus5,812,1
Fusobacterium prausnitzii3,47,1
Bifidobacterium adolescentis3,16,5
Eubacterium aerofaciens2,96
Peptostreptococcus productus2,75,6
Bacteroides thetaiotaomicron2,14,5
Eubacterium eligens1,73,7
Peptostreptococcus productus 1,63,3
Eubacterium biforme1,53,2
Eubacterium aerofaciens III1,22,5
Eubacterium rectale1,12,4
Bacteroides disatsonis1,12,4
Eubacterium rectale II1,12,3
Bifidobacterium longum0,91,8
Bifidobacterium infantis0,71,5
Lactobacillus acidophilus0,61,3
Bacteroides fragilis0,30,6
Bifidobacterium bifidum0,20,4
Escherichia coli0,20,4
Streptococcus salivarius0,20,4

Bacteroides-, Eubacterium-, Bifidobacterium-und Fusobacterium-Arten sind nach dieser Informationsquelle die häufigsten Darmbakterien beim Menschen. Es ist zu beachten, dass Tiere in ihrem Darm eine von dieser Auflistung abweichende Populationszusammensetzung haben. Auch Clostridium perfingens kommt mit Ausnahme des Pferdes und des Kaninchens in beträchtlicher Anzahl im Darm der Menschen und anderer Haustiere vor.


Zum Nachweis länger zurückliegender fäkaler Verunreinigungen in Gewässerproben ist Clostridium perfingens besser geeignet, als E. coli. Clostridium perfingens ist ein anaerober Keim, der außerhalb des Darms Endosporen bildet, die ihm ein längeres Überleben unter für ihn ungünstigen Wachstumsbedingungen erlauben. Solche Endosporen könnten eventuell sogar die Trinkwasserdesinfizierung überleben.

 

Das Idexx-Verfahren

Mit dem Idexx-Verfahren werden 100 ml Wasserprobe untersucht. Dazu wird dem Probewasser ein Mediumpulver zugemischt, geschüttelt und für mehrere Stunden im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Anzahl an gelbgefärbten bzw. unter UV-Licht fluoreszierenden Reaktionskammern ausgewertet.

Da dieses Nachweisverfahren auf Fluoreszenz beruht, ist es besonders nachweisstark. Daher können die Inkubationszeit der Proben kurzgehalten werden, was bei kritischen Trinkwasseruntersuchungen ein wichtiger Vorteil ist. Der Untersucher kann sehr schnell ein Gefährdungspotenzial abschätzen.

Abbildung 1: Analyse von zwei Wasserproben mit dem Idexx-Verfahren. Links: wenige Coliforme (d.h. dunkel gefärbte Kompartimente) und nur ein E. coli-haltiges Kompartiment. Rechts: Viele dunkelgelb gefärbte Kompartimente = viele Coliforme Keime. Drei dieser Kompartimente fluoreszieren unter UV-Licht der Wellenlänge 366 nm = enthalten E. coli.

 

Die Auswertung solcher Ansätze erfolgt beim Idexx-Verfahren nach einer ähnlichen McCrady Tabelle, wie mit der MPN-Methode in diesem Versuch.

Glossar

Darmflora

Gesamtheit der Mikroorganismen eines Darmes.

Leitkeim

ein charakteristischer Keim einer Bakterienpopulation, der in der Regel auch leicht zu bestimmen ist.

MPN

most probale number = die höchstwahrscheinliche Zahl. Statistisches Verfahren zur Ermittlung der Lebenzellzahl.

Probleme

 

Beobachtung Lösungsansatz
Die Luftblase geht vor dem Autoklavieren nicht aus dem Durham-Röhrchen Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm. Kippen Sie das Röhrchen dann einmal vorsichtig über seine Längsachse.
In keinem der Röhrchen ist Wachstum zu beobachten, obwohl viele Coliforme Bakterien in der Probe zu erwarten sind. Prüfen Sie, ob der pH-Wert der Probe und des Mediums im neutralen Bereich liegen. Prüfen Sie, ob bakterizide Substanzen in der Probe vorhanden sein könnten.

Sicherheit

Solange Sie mit einem geschlossenen System arbeiten und am Ende des Experimentes Ihre Ansätze durch Autoklavieren inaktivieren, ist keine Gefährdung erkennbar.

 

Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien
 
Abkürzungen, Gefahrensymbole, R+S-Sätze 100 KB

Tipps und Hinweise

  1. Für eine korrekte Probenahme in einem Gewässer ist es wichtig, die Probe 10-20 cm unterhalb der Gewässeroberfläche in der Mitte eines Flusses zu entnehmen. Daher sollten Sie eine Probenahmestange besitzen, in der die Probenahmeflaschen sicher festgehalten werden. Beachten Sie, die Flaschen erfahren einen Auftrieb, wenn Sie sie unter Wasser drücken.
  2. Verwenden Sie grundsätzlich nur sterilisierte Flaschen mit passenden sterilen Gummistopfen und Schraubverschlüssen.
  3. Werden die Proben länger als 4 Stunden bis zum Animpfen der Medien gelagert, dann müssen Sie dunkel aufbewahrt und auf Eis transportiert werden.
  4. Öffentliche Brunnen können eine ergiebige Quelle für solche Untersuchungen sein.
  5. Sie können aus einer Probenahme weitere Parameter der Gewässermikrobiologie bestimmen, z.B. Koloniebildende Einheiten, Coliforme, etc.
  6. Wenn Sie das Durham-Röhrchen ins Medium geben, um die Gasbildung zu bestimmen, dann muß vor dem Autoklavieren die meiste Luft aus diesem Röhrchen entfernt sein. Sie erreichen diesen Zustand, in dem Sie das große, mit Medium gefüllte Kulturröhrchen, mit Parafilm verschließen und einmal vorsichtig über seine Längsachse kippen. Dabei läuft das Durhamröhrchen voll Medium. Kleine Glasblasen im Durhamröhrchen sollten beim Autoklavieren entfernt werden.

Unterlagen

Die Zahlen geben die Dateigrößen in KB wieder. Zum Lesen der pdf-Dateien benötigen Sie den Adobe Acrobat Reader (einige Dateien wurden für Version 7 oder besser optimiert!). Zum Betrachten der ppt-Dateien benötigen Sie Microsofts PowerPoint. Deren Ausdruck als pdf-Datei erlaubt Ihnen die Herstellung von Folien für den Tageslichtprojektor.

Tipp: Laminieren Sie solche Seiten, die Sie häufiger als Arbeitsunterlagen nutzen möchten.

 

     
E. coli-Nachweis 1400 KB  
Selektiver E. coli-Nachweis 138 KB  
Namensgeber Herr Escherich 310 KB  
Fluorocult-Laurylsulfat Medium 230 KB  
Fluorgene Nachweise 30 KB  
Readycult System 390 KB  
Protokoll für Probennahme 25 KB  
Ergebnis-Protokoll 30 KB  
McCrady Auswertetabelle 580 KB  
Qualität von Badegewässern 95 KB  

Fragen

  1. Warum sollte die Probenahme unter der Wasseroberfläche stattfinden?
  2. Welche Gefahren könnten von fäkal verunreinigten Gewässern für Menschen ausgehen?
  3. Welche anderen Testverfahren wären für den Nachweis von fäkalen Verunreinigungen in Gewässern denkbar?
  4. Was verstehen Sie unter "Gesamtcoliforme"?
  5. Was verstehen Sie unter "KBE", was unter Gesamtkeimzahl?
  6. Welches Gas könnte aus dem Disaccharid Lactose gebildet werden?
  7. Warum werden Wasserkeime bei 28°C inkubiert, Coliforme und E. coli aus Wasserproben jedoch bei 37°C?