Fingerprinting

Zusatzinformationen

Informationen zu Primern | Analytik | Sequenzierung des menschlichen Genoms

 

Menschen besitzen ein komplexes Genom, das individuelle Unterschiede aufweist. Jeder Mensch hat also in bestimmten chromosomalen Abschnitten andere Nukleotidsequenzmuster, die bei seinen Mitmenschen verschieden sein können. Die Analyse mehrerer solcher Abschnitte kann daher zu einer sicheren Identifizierung von Individuen genutzt werden. Es wird also ein molekularbiologisches "Fingerprinting" möglich.

In der Intron/Exonstruktur des menschlichen Genoms kommen STR´s vor, das sind kurze, repetitive Sequenzen ("short tandem repeats") von jeweils 3-7 Basenpaaren. Die Anzahl dieser Wiederholungen ist individuen-spezifisch. Solche STR´s können bis zu 400 bp lang sein.

Abbildung 1: Schematische Darstellung zu den STR-Einheiten auf dem diploiden Chromosomensatz


Da jedes eukaryotische Individuum einen diploiden Chromosomensatz trägt, ist die Anzahl der Wiederholungen in der Regel auch für jeden der beiden Chromosomensätze unterschiedlich (heterozygot). In diesem Fall liefert die PCR auf einen repeat-Typ zwei Amplifikate von bis zu 300 Nukleotiden Länge. Die Primer für eine solche PCR liegen im flankierenden Bereich dieser Wiederholungseinheiten.

Abbildung 2: Einzellocus-Analyse, die in der Regel zwei PCR-Produkte je untersuchter Probe liefern.


Werden solche Proben zusammengemischt, dann ergibt sich eine "Allel-Leiter", wie sie rechts in Abbildung 2 dargestellt ist. Wird eine solche Allel-Leiter in einer Kapillare aufgetrennt, an deren Ende ein Detektor angebracht ist, dann ergibt sich eine Detektionskurve, wie sie in Abbildung 2 unten rechts gezeigt wird.

Abbildung 3: Analyse fluoreszenzmarkierter PCR-Produkte auf einem "Sequenzer", der mit einer Trennkapillare ausgestattet ist. Dargestellt ist die Trennung verschiedenfarbiger Produkte eines PCR Multiplex-Verfahrens.


Wird eine genügend hohe Anzahl verschiedener repeats aus unterschiedlichen Loci getestet, so ist statistisch sicher gestellt, dass die erhaltenen Längenmuster individuen-spezifisch sind. In der europäischen Kriminalistik werden routinemäßig etwa 7 verschiedene Loci auf ihre STR´s analysiert, über die in aller Regel bereits Verdächtige als mögliche Täter ausgeschlossen werden können. In USA werden bis zu 13 Loci durch die Bundespolizei FBI getestet.

Abbildung 4: Vom FBI in seiner CODIS-Datenbank (Combined DNA Index System) genutzte Loci und ihre Zuordnung zu den einzelnen Chromosomen des Menschen.


Die Allelverteilungen sind in verschiedenen Bevölkerungsgruppen genau untersucht worden. In bestimmten Loci, wie z.B. dem vWA, ergibt sich für die deutsche Bevölkerung folgende Verteilung:

Abbildung 5: Allel-Verteilung zum vWA-Locus in der deutschen Bevölkerung.

 

Wie in Abbildung 5 zu sehen ist, kommt das Allel 17 am häufigsten vor, das Allel 16 am zweithäufigsten.
 

Das "Amel" der Abbildung 4 dient der Geschlechtsbestimmung der untersuchten Personen über das Amelogenin Gen (ncbi, Zugriffsnummer AY040206, hier ab Nukleotid 4741). In dieser Analyse werden keine Reapts untersucht, sondern das Vorkommen von 6 zusätzlichen Nukleotiden des gleichen Gens im männlichen Y Chromosom. Ein Mann wird folglich zwei Banden zeigen, die sich um 6 Nukleotide unterscheiden, während eine Frau eine einzig kürzere Bande (homozygot) aufweist.

Abbildung 6: Analyse des "Amel"-Gens


Auf dieser Darstellung wird auch deutlich, dass verschiedene Primerpaare für die Analyse eines bestimmten Locus zu unterschiedlich langen PCR-Produkten führen können. Im obigen Beispiel liegen die Promega-Primer weiter von der zu untersuchenden Sequenz entfernt, lieferen also ein längeres PCR-Produkt des gleichen Locus.

Informationen zu Primern

CTT-Primer Set als Beispiel für eine "Multiplex-PCR" mit drei Primerpaaren.

STR Locuschromosom. PositionLocus Definition5´-3´repeat-Sequenz
CSF1PO5q33.3.34c-fms Proto-Oncogen für CSF1 das RezeptorgenAGAT
TPOX2q25.1.-pterThyroidperoxidase GenAATG
TH0111p15.5Tyrosinhydroxylase GenAATG

 

Analytik

An die Analytik der PCR-Produkte sind große Anforderungen gestellt. Ihr Trennsystem muss zwischen Fragmenten mit einer Differenz von 4 Basenpaaren bei durchschnittlich 200 Bp Länge unterscheiden können. Diese Anforderung ist mit Standard-Agarosegelen, mit denen z.B. Plasmide getrennt werden, nicht zu erreichen.

Derzeit werden die PCR-Produkte für gerichtsverwertbare Fingerprinting-Ansätze über fluoreszenzmarkierte Primer erhalten, die eine Trennung auf einem "DNA-Sequenzer" mit anschließender Laser-abhängiger Detektion erlauben. Solche Sequenzer können DNA-Moleküle mit einem Basenpaar-Unterschied klar auflösen.

 

Abbildung 7: Multiplex-PCR Analyse auf 8 Loci (oben) und auf 3 Loci (unten). Die Bereiche, in denen Signale (Produkte) zu erwarten sind, wurden für diese drei Loci angegeben. Die PCR-Produkte wurden auf einem DNA-Sequenzer aufgetrennt. (Dr. Wiegand)

 

Sequenzierung des menschlichen Genoms

Der Stand des Sequenzierungsprojektes des menschlichen Genoms (HGP) im Oktober 2004 kann in der offiziellen Nature-Publikation des IHGSC (International Human Genome Sequencing Consortium) in englischer Sprache nachgelesen werden (pdf, 804 KB). Weitere Informationen, insbesondere über die einzelnen Chromosomen, können vom ncbi Server erhalten werden.

 

Glossar

Allel

Eine Variante eines Gens, das sich an identischen Stellen (Loci) auf homologen Chromosomen einer Art befindet.

Diploidie

Vorhandensein von zwei vollständigen Chromosomensätzen in einer eukaryoten Zelle.

Exon

kodierender Sequenzabschnitt eines eukaryotischen Gens, der in mRNA überschrieben wird.

heterozygot

mischerbig, d.h. ein Gen existiert in zwei oder mehr verschiedenen Formen in einer Zelle

homozygot

Reinerbig, d.h. ein Gen kommt im doppelten Chromosomensatz in gleicher, identischer Form vor.

Intron

Sequemzabschnitt eines Gens, der nicht kodierend ist, also nicht in mRNA umgeschrieben wird, aus der dann das Protein gebildet wird. Dieser Sequenzabschnitt wird während des "Splicings" aus der RNA entfernt.

Locus

Position eines bestimmten Gens auf einer DNA-Sequenz.

Nukleotid

Einzelbaustein von Nukleinsäuren bestehend aus den drei Bestandteilen Base, Zucker und Phosphat.

repetitiv

ein DNA-Abschnitt kommt in mehreren Kopien in einem Genom vor.